CCK-8实验步骤，CCK8实验注意事项

　　CCK8试剂盒基于WST-8而广泛应用于细胞活性和细胞毒性检测的快速、高灵敏度试剂盒。
 

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CCK-8实验步骤

试剂盒可以用于细胞因子等诱导的细胞增殖检测，也可以用于抗癌药物等对细胞有毒试剂诱导的细胞毒性检测，或一些药物诱导的细胞生长抑制检测。
1. 制作标准曲线
a. 先用细胞计数板计数所制备的细胞悬液中的细胞数量，然后接种细胞；
b. 按比例依次用培养基等比稀释成一个细胞浓度梯度，一般要做 5-7 个细胞浓度梯度，每组 4-6 个复孔；
c. 接种后培养 2-4 小时使细胞贴壁，然后每 100 μL 培养基加 10 μL CCK-8 试剂培养一定时间后测定 OD 值，制作出一条以细胞数量为横坐标，OD 值为纵坐标的标准曲线。根据此标准曲线可以测定出未知样品的细胞数量。使用此标准曲线的前提条件是试验条件完全一致。

2. 细胞活性检测
a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
b. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ；
c. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
d. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

3. 细胞增殖-毒性检测
a. 在 96 孔板中接种细胞悬液 (100 μL/孔) ，将培养板放在培养箱中预培养 24 小时；
b. 向培养板加入不同浓度的待测药物；
c. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间；
d. 向每孔加入 10 μL 的 CCK-8 溶液 (注意不要产生气泡) ；
e. 将培养板置于培养箱内孵育 1-4 小时；
f. 用酶标仪测定在 450 nm 处的吸光度。

4. 计算公式
细胞存活率 =[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
抑制率 =[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液和药物溶液) ；
Ac: 对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8 溶液，不含药物) ；
Ab: 空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8 溶液，不含细胞、药物) 。

CCK-8 试剂盒检测细胞活性

注：如果待测药物有氧化性或还原性，可在加入 CCK-8 之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当待测药物影响比较小的情况下可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入待测药物后的空白吸收即可。

实验注意事项
1. CCK-8 的培养时间一般为 1-4 小时，但在培养 30 分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。
2. 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的 PBS 、水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
3. 本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，所以还原剂 (例如一些抗氧化剂) 会干扰检测，如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
4. 加入药物中如含有金属，对 CCK-8 显色有影响。终浓度为 1 mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制 5% 、15% 、90% 的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是 10 mM 的话，将会 100% 抑制。