二氢杨梅素Dihydromyricetin

　　二氢杨梅素Dihydromyricetin 是一种有效的二氢嘧啶酶 (dihydropyrimidinase) 抑制剂，IC50 为 48 μM。二氢杨梅素Dihydromyricetin 可通过抑制 mTOR 信号从而激活自噬。二氢杨梅素Dihydromyricetin 抑制 mTOR 复合体 (mTORC1/2) 形成。二氢杨梅素Dihydromyricetin 还是一种流感依赖 RNA 的 RNA 聚合酶抑制剂，IC50 为 22 μM。

 

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　　体外研究

 

　　二氢杨梅素Dihydromyricetin 是一种黄酮醇，可显著抑制二氢嘧啶酶对天然底物二氢尿嘧啶和异源底物 5-丙基-乙内酰脲的催化活性。二氢杨梅素Dihydromyricetin 对两种底物的二氢嘧啶酶活性均表现出显著的抑制作用，甚至超过 Myricetin。使用二氢尿嘧啶和 5-丙基乙内酰脲的滴定曲线确定，二氢杨梅素Dihydromyricetin 对二氢嘧啶酶的 IC50 值分别为 48±2 和 40±2 μM[1]。

 

　　二氢杨梅素Dihydromyricetin (DHM) 补充剂可显著逆转 D-gal 给药期间 mTOR 在 Ser2448 (p-mTOR) 磷酸化的增加，这表明 二氢杨梅素Dihydromyricetin 可通过抑制 mTOR 信号转导激活自噬[2]。

 

　　体内研究

 

　　通过 Morris 水迷宫 (MWM) 测试，评估了正常对照组、D-半乳糖组、D-半乳糖+二氢杨梅素Dihydromyricetin (100 mg/kg) 组和 D-半乳糖+二氢杨梅素Dihydromyricetin (200 mg/kg) 组大鼠的学习和记忆能力变化 (每组 n=10)。与 D-半乳糖诱导的模型组相比，二氢杨梅素Dihydromyricetin (DHM) 治疗显著缩短了逃避潜伏期[2]。

 

　　实验参考方法

 

　　激酶活性检测[1]

 

　　采用一种快速的分光光度法测定乙内酰脲酶（hydantoinase）、尿囊素酶（allantoinase）、二氢乳清酸酶（dihydroorotase）和咪唑酶（imidase）的酶活性。实验中以二氢尿嘧啶（Dihydrouracil）、5-丙基-乙内酰脲（5-propyl-hydantoin）和邻苯二甲酰亚胺（phthalimide）作为底物。除非另有说明，标准二氢嘧啶酶（dihydropyrimidinase）活性检测使用2 mM的二氢尿嘧啶作为底物。简要而言，在25°C下，分别通过监测底物二氢尿嘧啶、5-丙基-乙内酰脲和邻苯二甲酰亚胺水解时在230 nm、248 nm和298 nm处吸光度的下降来测定酶活性。反应开始时，将纯化的二氢嘧啶酶（10–70 μg）加入含底物和100 mM Tris-HCl（pH 8.0）的2 mL溶液中。使用紫外/可见光分光光度计监测底物的水解过程。各底物的消光系数通过分光光度计直接测定获得：二氢尿嘧啶在230 nm处为0.683 mM⁻¹cm⁻¹，5-丙基-乙内酰脲在248 nm处为0.0538 mM⁻¹cm⁻¹，邻苯二甲酰亚胺在298 nm处为3.12 mM⁻¹cm⁻¹。初始反应速率在吸光度变化速率为0.01–0.18 min⁻¹范围内与酶浓度呈线性关系。一个酶活力单位定义为每分钟催化1 μmol底物水解所需的酶量，比活力则以每毫克酶蛋白所含的活力单位数表示。动力学参数Km和Vmax通过将各实验测得的水解速率拟合至米氏方程（Michaelis-Menten equation），并采用非线性回归分析获得[1]。

 

　　MCE未独立验证上述方法的准确性，仅供参考。

 

　　细胞实验[2]

 

　　取大鼠海马和皮层组织样本，加入裂解缓冲液（含20 mM Tris（pH 7.5）、135 mM NaCl、2 mM EDTA、2 mM DTT、25 mM β-甘油磷酸钠、2 mM 焦磷酸钠、10%甘油、1% Triton X-100、1 mM 原钒酸钠、10 mM NaF、10 μg/mL 抑肽酶、10 μg/mL 亮抑蛋白酶肽、1 mM PMSF），冰上裂解30分钟，随后在4°C下以12,000×g离心30分钟。收集上清液，使用BCA试剂盒进行蛋白质定量。蛋白样品加入上样缓冲液后于95°C煮沸5分钟，经SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离后转至硝酸纤维素膜（nitrocellulose membrane），再用相应的特异性一抗和二抗进行孵育。最后通过增强型化学发光（ECL）试剂显色，并曝光于X光片以检测目标蛋白[2]。

 

　　动物给药[2]

 

　　大鼠实验[2]

 

　　共使用40只雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（年龄8周，体重160±20 g），随机分为四组：正常对照组、D-半乳糖（D-gal）模型组、D-gal联合低剂量DHM（100 mg/kg·d）组和D-gal联合高剂量DHM（200 mg/kg·d）组，每组10只。所有大鼠饲养于温度22±2°C、昼夜循环12小时:12小时的环境中，自由摄食饮水。适应环境1周后，DHM给药组大鼠每日上午8:00通过灌胃给予溶于蒸馏水中的DHM，剂量分别为100和200 mg/kg，连续给药6周；正常对照组灌胃给予等量蒸馏水。除正常对照组外，其余各组大鼠每日皮下注射D-gal（150 mg/kg·d），连续6周。每次DHM给药需在D-gal注射前2小时进行。

 

　　MCE未独立验证上述方法的准确性，仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[1]. Huang CY. Inhibition of a Putative Dihydropyrimidinase from Pseudomonas aeruginosa PAO1 by Flavonoids and Substrates of Cyclic Amidohydrolases. PLoS One. 2015 May 19;10(5):e0127634.

 

　　[2]. Chang H, et al. Ampelopsin suppresses breast carcinogenesis by inhibiting the mTOR signalling pathway. Carcinogenesis. 2014 Aug;35(8):1847-54.