D-萤光素钠盐D-Luciferin sodium作用

　　D-萤光素钠盐D-luciferin sodium 是荧光素酶 (Luc) 的天然底物，对萤火虫产生典型的黄绿光进行催化。该反应产生的 560 nm 化学发光在几秒钟内达到峰值，当底物荧光素过量时，光输出与荧光素酶浓度成正比。荧光素酶 (luc) 基因是研究和活性分子筛选的常用报告基因。化学发光技术实际上是无背景的，使得 luc 报告基因成为检测低水平基因表达的理想选择。在标准荧光计数仪中可以可靠地测量到 0.02 pg 的荧光素酶。除了用于基因表达的外，荧光素酶还用于 ATP 的检测。

 

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　　生物活性

 

　　体外研究

 

　　1. 注意事项

 

　　a) D-萤光素盐易溶于水性缓冲液 (pH 6.1-6.5)，溶解度最高可达 100 mM。储备液可用不含 ATP 的水配制，并在 -20°C 下避光保存。游离酸必须用适当的碱中和才能溶解。在较高的 pH 值下，荧光素会在碱催化下形成脱氢荧光素，并外消旋化为 L-异构体。

 

　　b) D-荧光素可用于任何现有的报告分析或 ATP 分析系统。

 

　　c) 如果测试 ATP，请戴上手套并使用不含 ATP 的容器，以尽量减少所有可能的 ATP 污染源。仅使用无菌的无 ATP 水和试剂。使用高压灭菌水制备所有试剂。

 

　　2. 实验方案

 

　　本方案仅提供一个指导，应根据您的具体需要进行修改。

 

　　以下方案是钾和钾的示例钠盐制备。它适用于大多数细胞类型和体内动物使用。

 

　　2.1 体外生物发光图像分析的示例方案

 

　　a) 在无菌水中制备 100 mM (100-200X) 荧光素原液。拌匀。立即使用，或一次性分装，-20°C保存，避免冻融循环，避免光照。

 

　　b) 制备0.5-1 mM D-Luciferin工作液于pre-加热的组织培养基。

 

　　c) 从培养的细胞中吸出培养基。

 

　　d) 向细胞中加入荧光素工作溶液，并在成像前将细胞在 37°C 下孵育 5-10 分钟。

 

　　2.2 体内生物发光图像分析的示例方案

 

　　a) 在 DPBS 中制备 15 mg/mL 荧光素原液，不含 Mg2+ 和 Ca2+。混合均匀。

 

　　b) 过滤器通过 0.2 μM 过滤器对溶液进行除菌。立即使用，或一次性分装，并储存在 -20°C，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

 

　　c) 成像前 10-15 分钟腹膜内 (ip) 注射荧光素在动物体重的 150 mg/kg (或 10 μL/g 荧光素原液) 下。

 

　　注意：应对每个动物模型进行荧光素动力学研究以确定峰值信号时间。

 

　　2.3 荧光素报告基因检测的示例方案

 

　　a) 在无菌水中制备 100 mM 荧光素原液。立即使用，或一次性分装，-20°C 保存，避免冻融循环，避免暴露在光线下。

 

　　b) 制备 1 mM 的 D-Luciferin 工作溶液和 3 mM ATP，1 mM DTT 和 15 mM MgSO4 在 25 mM Tricine 缓冲液 pH 7.8 中。

 

　　c) 将 5-10 μL 细胞裂解物移至微孔板中。使用裂解试剂或不含裂解物的缓冲液作为空白。

 

　　d) 根据制造商的说明用荧光素工作溶液灌注发光计。

 

　　e) 立即注入 200 μL 荧光素工作溶液，积分时间为 10 s.

 

　　体内研究

 

　　使用萤火虫荧光素酶 (Fluc) 作为报告基因和 D-荧光素作为底物的生物发光成像 (BLI) 是目前应用最广泛的技术。将总信号强度与 D-荧光素注射后的时间作图，以生成时间-强度曲线。除了峰值信号外，D-荧光素注射后固定时间点 (5、10、15 和 20 分钟) 的信号被确定为峰值信号的替代信号。给定时间-强度曲线中的信号针对曲线中的峰值信号进行归一化，以表示 D-荧光素注射后的时间变化模式[3]。

 

　　注入 10 μL每克体重的 D-萤光素 (腹膜内或静脉内) 储备液：标准 150 mg/kg 注射的 20 g 小鼠通常约 200 μL。

 

　　解冻 D-萤光素 (钾盐或钠盐) 室温并溶解在 dPBS (不含钙或镁) 中，最终浓度为 15 mg/mL。通过 5-10 mL 的无菌 H2O 润湿 0.22 μM 过滤器并丢弃水。通过准备好的 0.22 μM 注射器过滤器对 D-荧光素溶液进行消毒。

 

　　注射入体内 10-20 min (待光信号达到最强稳定平台期)，再进行成像分析。

 

　　注意：建议对每只动物模型都需要建立荧光素酶动力学曲线，从而确定最高信号检测时间和信号平台期。荧光素注射注入小鼠体内后，约 1 min 可扩散到小鼠全身。

 

　　对于腹腔注射来讲，扩散较慢，开始发光较慢，持续发光时间较长。

 

　　对于荧光素的尾部静脉注射，扩散快，开始发光快，但发光持续时间较短。

 

　　动物给药[3]

 

　　小鼠实验[3]

 

　　在接种HCT116-Luc细胞后第3、5、7、10、12、14、19、21、24和28天，使用冷却式电荷耦合器件（CCD）相机系统（IVIS成像系统100）进行活体生物发光成像（in vivo BLI）。小鼠于肩胛部皮下注射75 mg/kg的D-荧光素钠溶于100 μL磷酸盐缓冲液（PBS）中，随后置于成像系统的密闭暗室中。从注射后5分钟开始，以每分钟1张图像的频率连续采集背侧发光图像，单次曝光时间为1秒，持续至注射后20分钟。在第3天和第5天，数据采集延长至注射后40分钟；在第7天延长至25分钟，以适应发光信号持续时间的延长。成像时设定像素合并（binning）为4，视野（field of view）为15 cm。

 

　　MCE未独立验证上述方法的准确性，仅供参考。

 

　　参考文献

 

　　[3]. Inoue Y, et al. Timing of imaging after d-luciferin injection affects the longitudinal assessment of tumor growthusing in vivo bioluminescence imaging. Int J Biomed Imaging. 2010;2010:471408.